-5Tg和Es-null供体的BM的嵌合小鼠没有表现出转移数量和肿瘤负荷的增加。这些结果证实嗜酸性粒细胞增多对于增加Il-5Tg小鼠的骨转移是必不可少的。

    3.嗜酸性粒细胞直接支持肿瘤细胞迁移和转移形成

    鉴于观察到Il-5Tg小鼠早期骨转移增强，我们研究了嗜酸性粒细胞是否能直接促进肿瘤细胞的生存和生长。我们研究了嗜酸性粒细胞是否可以直接促进肿瘤细胞的存活和生长。通过进行体外实验，在不存在嗜酸性粒细或存在嗜酸性粒细胞的情况下培养肿瘤细胞，我们发现肿瘤细胞的克隆活性没有明显改变。考虑到嗜酸性粒细胞可能会诱导肿瘤细胞凋亡和坏死，我们评估了与嗜酸性粒细胞共培养的肿瘤细胞的存活率。没有发现嗜酸性粒细胞对肿瘤细胞死亡的显着影响。类似的发现表明，有或没有嗜酸性粒细胞，EdU阳性增殖肿瘤细胞的比例没有明显差异，肿瘤细胞的细胞周期也没有变化。这些结果表明嗜酸性粒细胞对改变肿瘤细胞生长没有实质性影响。

    随后，我们在体外进行了迁移实验。在培养过程中，与嗜酸性粒细胞直接或间接接触后，肿瘤细胞的迁移能力显著增强，提示嗜酸性粒细胞以接触无关的方式促进肿瘤细胞的迁移。用来从Il-5Tg小鼠和对照小鼠的BM上清液进行迁移试验，研究结果表明，嗜酸性粒细胞来源的因子可能促进肿瘤细胞迁移。

    我们将肿瘤细胞与嗜酸性粒细胞混合，然后将混合物静脉内共注射到WT小鼠中，与单独注射肿瘤细胞相比，这导致肺转移增加。在平行实验中，嗜酸性粒细胞在肿瘤细胞静脉注射后立即被过继转移（气管内），这导致了类似的结果。

    接下来我们研究了嗜酸性粒细胞与癌症患者转移之间的关系。与非癌症患者的胸腔积液相比，胸膜转移患者的恶性胸腔积液(MPE)检测到更多的嗜酸性粒细胞(图4，A和B)，其他免疫细胞包括巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞没有变化。

    4.CCL6在嗜酸性粒细胞诱导的肿瘤细胞迁移和嗜酸性粒细胞依赖的转移形成中至关重要

    我们的目的是确定嗜酸性粒细胞促进肿瘤细胞迁移和转移形成的有效因素。既往研究报道CCL2、CCL3、CCL5、CCL6、CCL8、CXCL12、CXCL14等细胞因子和趋化因子直接或间接靶向肿瘤细胞促进转移。我们采用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)从Il-5Tg小鼠和WT小鼠的BM细胞中筛选一组细胞因子和趋化因子。CCL6是Il-5Tg小鼠中最丰富的细胞因。由于CCL23已被确定为小鼠CCL6的人类同源基因，我们随后评估了人类样本中的CCL23水平，并发现相对于非癌症患者的胸腔积液，MPE中CCL23浓度增加(图4D)。此外，CCL6的高分泌主要在嗜酸性粒细胞中发现(图4E)。为了确定嗜酸性粒细胞衍生的CCL6是否参与肿瘤细胞迁移和转移，我们产生了Ccl6敲除小鼠（Ccl6??）并将它们与Il-5Tg小鼠（Il-5Tg和Ccl6??）杂交。相对于Il-5Tg小鼠，Il-5Tg和Ccl6??小鼠的嗜酸性粒细胞的基础数量没有差异。分离来自Il-5Tg小鼠的Es和来自Il-5Tg和Ccl6??小鼠的EsCcl6??两种类型的嗜酸性粒细胞以进行体外迁移测定，值得注意的是，向EsCcl6??迁移的肿瘤细胞的数量减少了。

    嗜酸性粒细胞或CCL6缺失不影响体内基线肺转移(图S10，C和D)，而嗜酸性粒细胞CCL6缺失显著减少嗜酸性粒细胞依赖性肺转移。与Il-5Tg小鼠相比，Il-5Tg和Ccl6小鼠通过尾动脉注射肿瘤细胞后骨转移也少得多。此外，静脉注射肿瘤细胞后，在CCL6缺乏的Il-5Tg小鼠中，骨转移数的增加和肿瘤负荷均有所降低。总之，这些观察结果表明CCL6在体内对嗜酸性粒细胞诱导的肿瘤细胞迁移和嗜酸性粒细胞依赖的转移形成至关重要。

    5.抑制CCL6受体CCR1可减轻肿瘤细胞迁移和转移的形成

    据报道，CCR1是一种推定的CCL6受体。我们探讨了嗜酸性粒细胞衍生的CCL6是否可以通过CCR1将肿瘤细胞募集到转移部位。我们通过shRNA稳定敲除B16-F10细胞中的CCR1，慢病毒非靶向shRNA作为对照。CCR1缺陷的B16-F10（shCCR1B16-F10）细胞向嗜酸性粒细胞或嗜酸性粒细胞培养上清液的迁移显着减少。CCR1缺陷的B16-F10细胞在Il-5Tg小鼠中也显示出较少的骨转移，在OVA攻击的小鼠中显示出较少的肺转移。这些结果证明，CCR1在肿瘤细胞中的表达对于嗜酸性粒细胞诱导的肿瘤细胞迁移和转移形成至关重要。

    我们通过使用CCR1特异性抑制剂BX471进一步检测了CCR1抑制对肿瘤细胞的影响。BX471显着减弱了体外嗜酸性粒细胞上清液诱导的B16-F10细胞的迁移。BX471处理的肿瘤细胞在体内发